Uma equipe do Centro Helmholtz de Pesquisa de Infecções em Würzburg, Alemanha, liderada pelo especialista em RNA Chase Beisel, desenvolveu uma nova tecnologia para a detecção precisa de RNA usando nucleases Cas12 de corte de DNA.
Os sistemas CRISPR-Cas, sistemas de defesa em bactérias, tornaram-se uma fonte abundante de tecnologias para diagnósticos moleculares. Pesquisadores do Instituto Helmholtz para Pesquisa de Infecção Baseada em RNA (HIRI) em Würzburg expandiram essa extensa caixa de ferramentas. Seu novo método, chamado PUMA, permite a detecção de RNA com nucleases Cas12, que naturalmente têm como alvo o DNA. O PUMA promete uma ampla gama de aplicações e alta precisão. A equipe publicou seus resultados no periódico Nature Communications.
As bactérias desenvolveram mecanismos especiais de defesa para se protegerem contra vírus, que de forma alguma infectam apenas humanos. Como parte desses chamados sistemas CRISPR-Cas, um ácido ribonucleico CRISPR (crRNA), que serve como um “RNA guia”, reconhece regiões de um genoma estranho, como o DNA viral. A nuclease associada ao CRISPR (Cas), direcionada por um crRNA, então o torna inofensivo cortando-o como uma tesoura. Os humanos exploraram essa estratégia: “CRISPR, frequentemente chamada de ‘tesoura genética’, é a base de muitas tecnologias moleculares”, diz Chase Beisel, chefe do departamento de Biologia Sintética de RNA no Instituto Helmholtz para Pesquisa de Infecção Baseada em RNA (HIRI) em Würzburg. O instituto é um local do Centro Braunschweig Helmholtz para Pesquisa de Infecção (HZI) em cooperação com a Julius-Maximilians-Universität (JMU) de Würzburg, onde Beisel é professor.
A plataforma de diagnóstico LEOPARD, desenvolvida pelo laboratório de Beisel em cooperação com a JMU em 2021, também alavanca o CRISPR como uma tecnologia. O LEOPARD tem o potencial de detectar uma variedade de biomarcadores relacionados a doenças em apenas um teste. A abordagem é baseada na reprogramação de fatores de RNA, os chamados tracrRNAs. Esses RNAs estão naturalmente envolvidos em ajudar a produzir RNAs guia usados por Cas9 e diferentes nucleases Cas12. “O LEOPARD se concentrou em Cas9. No entanto, os sistemas CRISPR-Cas também incluem outro conjunto diverso de nucleases, chamado Cas12”, explica Beisel. Enquanto Cas9 e Cas12 cortam alvos de DNA, Cas12 pode aumentar o sinal de saída realizando cortes em DNA “colateral”. Isso pode tornar as tecnologias de detecção mais sensíveis e, portanto, mais eficientes.
A equipe liderada por Chase Beisel agora estendeu os recursos exclusivos do LEOPARD para Cas12. Os pesquisadores nomearam o método resultante PUMA (Programmable tracrRNAs Unlock protospacer-adjacent Motif-independent detection of ribonucleic Acids by Cas12 nucleases). Os detalhes de suas descobertas são o assunto de um artigo no periódico Nature Communications.
Superando Obstáculos Funcionais
Embora as nucleases Cas12 sejam amplamente utilizadas em diagnósticos moleculares, duas grandes limitações persistem: as tecnologias baseadas em Cas12 foram restritas a alvos de DNA, e uma sequência de reconhecimento específica chamada PAM, abreviação de protospacer-adjacent motif, é necessária para identificar a molécula alvo.
O PUMA aborda esses desafios de forma elegante. Assim como o LEOPARD, esse novo método também depende de tracrRNAs. “Usando o PUMA, podemos reprogramar os tracrRNAs. Isso nos permite decidir qual biomarcador de RNA se torna um RNA guia. Esse RNA guia, por sua vez, direciona o Cas12 para uma molécula de DNA que fornecemos e ativa a tesoura genética”, explica o primeiro autor do estudo, Chunlei Jiao. Chunlei Jiao, ex-aluno de pós-graduação e pesquisador de pós-doutorado no laboratório Beisel, também esteve envolvido no desenvolvimento do LEOPARD. Ele começou recentemente uma cátedra na Universidade Nacional de Cingapura. “O corte de DNA então nos diz qual biomarcador estava presente na amostra, como biomarcadores específicos para diferentes patógenos”, acrescenta Beisel.
O novo método, portanto, permite a detecção de biomarcadores de RNA usando nucleases CRISPR que normalmente só podem reconhecer DNA. “Isso é particularmente importante para biomarcadores moleculares que só podem ser encontrados no nível de RNA. Isso inclui vírus de RNA, por exemplo”, diz Beisel. E, no entanto, o PUMA não requer uma sequência de reconhecimento específica: o PAM está contido na molécula alvo de DNA fornecida. Como os pesquisadores fornecem a molécula alvo, eles também podem introduzir DNA truncado. Como resultado, eles foram capazes de aumentar significativamente a velocidade do método.
Vários pássaros, uma pedra
“O PUMA tem o potencial de se tornar uma ferramenta flexível e precisa para detecção de RNA”, conclui Beisel. Finalmente, a equipe demonstrou o potencial do método identificando cinco patógenos bacterianos associados à sepse aguda. Sua detecção se baseou em um único tracrRNA universal reprogramado, que fornece um meio simplificado de diferenciação entre vários tipos de bactérias. Isso abre uma ampla gama de aplicações potenciais na medicina: “A nova tecnologia representa uma nova forma de diagnóstico CRISPR que permite testes moleculares confiáveis no ponto de atendimento, seja para a identificação de patógenos virais ou bacterianos ou para a detecção de biomarcadores de câncer”, diz Jiao.
A equipe de pesquisa já está planejando seus próximos passos: “Nosso objetivo é obter uma leitura multiplexada semelhante à do LEOPARD e expandir a gama de aplicações da tecnologia”, diz Beisel, que também prevê amplo uso na comunidade de pesquisa: “Esperamos que nosso estudo estimule uma maior exploração da reprogramação do tracrRNA.
Publicação original
Jiao C, Peeck NL, Yu J, Ghaem Maghami M, Kono S, Collias D, Martinez Diaz SL, Larose R, Beisel CL (2024) A reprogramação de TracrRNA permite a detecção direta independente de PAM de RNA com diversas nucleases Cas12 direcionadas a DNA. Nature Communications, DOI: 10.1038/s41467’024 -50243-x
